前言：
在农业领域，害虫对农作物的威胁一直是制约农作物产量和质量的重要因素之一，为了减少化学农药的使用，提高农业生产的可持续性，研究人员一直在寻找更加环保和有效的方法来控制农作物害虫。
其中利用生物农药和生物控制方法逐渐引起了广泛的关注。
长枝木霉作为一种常见的真菌生物农药，具有多种生物学特性，它一直被广泛研究用于植物病害的防治。
而几丁质酶作为长枝木霉的代表性产物之一，具有分解几丁质的能力，在植物与害虫之间的互作中扮演着重要角色。
最近我们开始研究利用长枝木霉几丁质酶来控制棉花植株中的棉蚜这一棉花重要害虫的方法。
本文的研究成果将为利用长枝木霉几丁质酶来控制棉蚜等农作物害虫提供重要的理论基础和实践指导。
一、实验介绍
1.1实验的出发点
农作物容易受到包括植物病原体在内的许多生物因素的侵袭，大多数情况下，害虫不仅造成产量损失，而且影响农产品的整体质量和数量。
而我们要做的是控制世界上对于经济增长较为重要的植物棉花中的害虫棉蚜。
棉蚜作为棉花的一种恶性害虫，通常从棉花的维管植物部分吸取韧皮部汁液，并在吸取的过程中能制造和传播75种植物病毒。
大部分农作物通常使用各种杀虫剂来防止害虫，但这也会导致农药过来产生的经济损失，以及农药分布不均匀导致害虫消灭不全，也大大降低了农作物的健康情况。
在最近几年，人们发现了一种新的方法来控制害虫，就是利用昆虫病原真菌（EPF）也叫木霉。
木霉是一种真菌，有不同的类型，比如T. afroharzianum和T. atroviride，它们被发现可以在不同的蚜虫生长阶段中用来控制害虫。
研究到目前为止，显示木霉能够通过几种方式来直接控制害虫数量。
它们可以寄生在害虫体内，对害虫产生影响。其次这些木霉会产生一些次生代谢物，这些物质附着在植物上能驱逐害虫。
而且木霉还有一些特殊的特点，会向被感染的害虫发布不进食的信号，从而降低害虫的数量。
除了直接影响害虫，木霉还可以通过一些间接方式来控制害虫。一种方式是，木霉的代谢物能激活植物的自我防御机制，使其更难受到害虫的侵害。
另一种方式是吸引害虫的天敌，让它们帮助控制害虫数量。
因为木霉和其他方法相比，控制害虫的方式不同，所以在实际田间使用时可能会有一些困难。而我们正在使用生物技术的方法，寻找特殊的基因分泌的特定酶，这些基因可以被放入植物的基因里，让植物从生长初期就对特定害虫具有抵抗能力。
昆虫的身体表面通常由一层叫做外角质层的东西保护着，就好像人类的皮肤一样。这个外角质层主要由一种叫做几丁质的物质构成，里面还混合着一些蛋白质。
而昆虫病原真菌（EPF）的微生物可以对这个外角质层产生一些特殊的化学物质，这些物质可以分解昆虫体表的几丁质，从而吸收养分。
这种真菌产生的化合物叫做细胞外酶。
这些真菌产生的酶有一种特殊的能力，可以把几丁质变得不那么坚固，昆虫的身体主要由几丁质构成，而这个物质在他们身体中占据了很大的比例，大约有40%。
考虑到这一点，我们认为，可以利用这些真菌产生的特殊酶，来开发一些基因改造的植物，让这些植物能够有效地控制害虫，特别是蚜虫。
用实验过程来说，这项研究的目标是利用真菌产生的特殊酶，来帮助植物对抗害虫。通过改变植物的基因，使其能够产生这些酶，我们可以期望创造出更加强大的植物，能够更好地应对害虫的侵害。这将有助于减少对化学农药的使用，从而更加环保地管理农作物。
二、实验材料准备
2.1内切几丁质酶Chit1的分离
我们的研究中首先从T. longibrachiatum的基因组中提取了几丁质酶基因，然后用一种叫做PCR的技术制备了大约1千碱基长的DNA片段，这个片段与几丁质酶基因有关。
我们用一种叫做限制性消化的方法来验证这个几丁质酶基因片段的部分重新组合，然后用M13引物进行了测序，就是读取了这个基因片段的DNA序列。
之后我们使用一个叫做GENE TOOL的工具，从这个DNA序列中去掉了与载体（一种携带基因的工具）有关的部分，然后进行了一种叫做BLAST分析的方法。
这个分析的结果显示，这个几丁质酶基因的核苷酸序列与其他昆虫病原真菌相比，与内切壳多糖酶有最大的相似性。
具体来说这个几丁质酶基因的核苷酸序列与同种真菌T. longibrachiatum中的一个叫做Chit1的几丁质酶基因的核苷酸序列有99.52%的显著相似性。
2.2内切几丁质酶Chit1的蛋白质的一些特性和结构进行分析的情况
长臂木霉的内切几丁质酶基因由216个氨基酸构成，这个基因编码出来的蛋白质分子的重量大约是23.41千道尔顿。
这个蛋白质具有酸性，其pI值为4.5，意味着在一定条件下它会带有正电荷，以长臂木霉为例，对这个基因序列进行分析可以揭示出这个基因的来源，从而提取正确的基因进行合成。
这个基因拥有催化糖基水解酶家族18的结构域，这就是它的一种特殊结构。对蛋白质序列进行比对，可以显示出这个特殊结构的一些基本序列。
在这个结构中，有一个催化结构域DGIDVDWEYP（通常用DxxDxDxE来表示），这个结构在几丁质酶基因中是比较保守的，意味着在不同物种中都存在。
蛋白质的第6个氨基酸是底物结合的位置，而第43个氨基酸则是催化剂活性的位置，这两个位置对于蛋白质的功能非常重要。
与长臂木霉的不同菌株的基因序列进行比对，发现其相似性高达99%，这表示这个基因在不同的木霉菌株之间非常相似，可以用于合成。
2.3关于长臂木霉（T. longibrachiatum）的系统发育分析的内容
研究人员通过进行系统发育分析，发现不同种类的木霉在其几丁质酶基因方面存在着遗传上的差异。
在进行系统发育树分析时，他们发现从不同真菌分离出的几丁质酶被归类到不同的进化分支上。在这些分支中，有一类几丁质酶被称为18类基本几丁质酶，它们之间显示出最大的相似性。
长臂木霉被归类到相对较远的进化分支上，与同属的另一株长臂木霉（T. longibrachiatum）的Chit1几丁质酶（KJ787131）表现出最高的相似性。
通过比较不同种类的几丁质酶的基因序列，研究揭示了内切壳多糖酶Chit1与18糖基水解酶家族之间存在紧密的关联。
实验结果表明这个基因可以有效的与长臂木霉融合。
三、实验方法
3.1从长枝木霉真菌中分离几丁质酶基因的过程，以及基因提取和扩增的步骤
首先，这个真菌（长臂木霉）的培养物所使用的真菌菌株（FCBP-EPF-1491）最初是从粉虱这种昆虫中分离出来的。
然后使用一种叫做CTAB缓冲液的溶液，在预热65度的情况下，从粉虱的DNA中提取基因。接着，他们混合了提取的溶液和氯仿，并进行了离心操作，以便分离上清液，之后再次混合上清液和异丙醇，再次离心，然后用乙醇进行洗涤。
这样做的目的是为了提取纯净的DNA，以便实验的准确性。
接下来制备了一种叫做PCR反应混合物，其中包括不含DNA酶的水、一种叫做dNTPs的化合物、Taq聚合酶（一种在DNA复制中使用的酶）、MgCl2（一种帮助DNA复制的化合物）、缓冲液、引物（用于扩增目标基因的DNA片段）以及基因组DNA作为模板。
几丁质酶基因的扩增过程是通过一个循环反复进行的过程，在一定的温度条件下进行。这个过程涉及到DNA的分离、复制和合成，最终得到目标基因的复制品。
3.2几丁质酶 ORF 的分离
首先我们需要从质粒中提取出所需的几丁质酶的ORF，这是基因中编码蛋白质的一部分。为了进行这个过程，我们设计了一对引物，这些引物是用来在PCR反应中复制和放大ORF的特定片段的。
值得注意的是，每个引物的正向引物末端包含一个EcoRI限制性酶切位点，而反向引物末端则包含一个NheI限制性酶切位点。
接着使用设计好的引物对之前克隆在pGEM T-easy克隆载体中的T. longibrachiatum的几丁质酶ORF进行扩增。
扩增的过程涉及到多个步骤，首先是在95°C下进行一段时间的初始变性，然后重复多次的变性和退火循环。
在退火的过程中，温度根据目标基因的特性进行调整，这里以T. longibrachiatum的Chit1基因为例，退火温度为56°C，最后在延伸阶段，温度为72°C，这个阶段是用来合成新的DNA链。
整个PCR过程的条件和步骤都是为了在试管中复制出目标基因的特定片段，以便进一步的研究和分析。
实验物搜集完毕，接下要把合成的基因用特殊的方式注射以融合基因。
3.3粒子轰击/生物射弹轰击
实验开始之前我们收集了常见的棉花种子，并将这些种子种植在带有正常条件的盆栽土壤中的花盆里。
每个花盆种植了五颗种子，然后观察这些种子的生长情况，等到第一片真正的叶子出现，通常在10到15天之后。
这个实验被重复了五次，每次重复包含五个盆子，每个盆子里有五个幼苗，所有这些幼苗的叶子都会接受生物射弹处理，然后被转移到新的独立花盆中。
这些花盆被放置在生长室中，具有15小时的光照和9小时的黑暗，光照强度为890 μmol m -2 s -1，温度在大约23-25°C之间。在接下来的前38周内，使用一种叫做MIRACLE-GRO的肥料进行了两到三次的施肥。
在一定的温度和湿度条件下，对幼苗进行了分析。幼苗被种植在带有不同盆栽混合物（泥炭和豌豆砾石的混合）的塑料杯中，然后将其转移到大约1500毫升容量的花盆中，对所有花盆进行了三到四次的施肥，使用不同的肥料和稀释的溶液。
在实验中需要使用了一种称为微弹的技术，将具有特定基因的DNA载体注入植物组织中。这个过程涉及将DNA包裹的微弹通过特定设备进行射击，以将基因引入植物组织中。
这个实验中使用了两个不同的组分，其中一个带有Chit1基因，另一个带有另一种CLCrV基因。这样的实验可以模拟植物中是否存在特定基因。
四、总结
实验从棉花种子的生长开始，经过种植、生物射弹接种和肥料处理等步骤，获得了接种了Chit1基因的棉花植株。
结果显示，在特定温度和湿度条件下，生物射弹接种方法达到了高达80%的感染率，经过4天对植物的观察，害虫在不断的减少，这也进一步证实了这组合成基因的可行性。
该实验为利用几丁质酶基因改良棉花抵御棉蚜害虫的控制方法提供了有益的实验基础。
